Biosíntesis innovadora, inteligencia artificial.

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 21851 (2022) Citar este artículo

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La estrategia basada en microbios en nanotecnología ofrece ventajas económicas, ecológicas y de bioseguridad sobre los protocolos químicos y físicos tradicionales. El estudio actual describe un nuevo protocolo de biosíntesis de nanopartículas de quitosano (CNP), empleando un pionero Streptomyces sp. cepa NEAE-83, que exhibió un potencial significativo para la biosíntesis de CNP. Se identificó como cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus según sus propiedades morfológicas y fisiológicas, así como la secuencia de ARNr 16S (número de acceso de GenBank: MG384964). Los CNP se caracterizaron por SEM, TEM, EDXS, potencial zeta, FTIR, XRD, TGA y DSC. La biosíntesis de CNP se maximizó utilizando un modelo matemático, el diseño compuesto central centrado en las caras (CCFCD). El mayor rendimiento de CNP (9,41 mg/ml) se obtuvo en el experimento n.º 27, usando un pH inicial de 5,5, 1% de quitosano, 40 °C y un período de incubación de 12 h. De manera innovadora, se utilizó la red neuronal artificial (RNA) para validar y predecir la biosíntesis de CNP basándose en los datos de los ensayos del CCFCD. A pesar del alto grado de precisión de ambos modelos, ANN fue suprema en la predicción de la biosíntesis de CNP en comparación con CCFCD. ANN tuvo una mayor eficacia de predicción y valores de error más bajos (RMSE, MDA y SSE). Los CNP biosintetizados por la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus mostraron actividad antibacteriana in vitro contra Pectobacterium carotovorum, que causa la pudrición blanda de la papa. Estos resultados sugirieron su posible aplicación para controlar las enfermedades destructivas de la pudrición blanda de la papa. Este es el primer informe sobre la biosíntesis de CNP utilizando un material recién aislado; Streptomyces microflavus cepa NEAE-83 como enfoque ecológico y optimización del proceso de biosíntesis mediante inteligencia artificial.

Los actinomicetos comprenden un grupo amplio y único de actinobacterias grampositivas y aeróbicas, que tienen un alto contenido de GC en el genoma (69-73%). Los actinomicetos producen sustrato ramificado y micelio aéreo que se desarrolla en cadenas de esporas formando paredes transversales en los filamentos aéreos multinucleados. Este grupo de bacterias se distribuye ampliamente en el suelo y tiene abundantes patrones de pigmentación1,2. Debido a su capacidad para producir numerosos metabolitos secundarios con valor agregado y varias aplicaciones en procesos biológicos, las especies de Streptomyces son las de mayor importancia industrial entre los actinomicetos3,4,5. Una aplicación prometedora y de reciente aparición de los actinomicetos es su aplicación en la biosíntesis de nanopartículas1,6.

En los últimos años, las nanopartículas han atraído una gran atención debido a sus fascinantes propiedades7. En comparación con los materiales a granel, las nanopartículas tienen una alta actividad de reacción debido a su mayor relación superficie-volumen8. Generalmente, las nanopartículas podrían generarse por rutas químicas, físicas, mecánicas o biológicas9.

Existen métodos no biológicos que proporcionan sistemas nanoestructurados biocompatibles sin el uso de materiales nocivos o de alto costo, como el quitosano o la albúmina con tripolifosfato de sodio (TPP)10,11,12. A pesar de esto, una serie de obstáculos contribuyen a las limitaciones de los métodos no biológicos, incluido el alto costo, la utilización de alta presión, energía, temperatura, compuestos peligrosos y el gran tamaño de partículas13. Los productos químicos peligrosos limitan el uso de nanopartículas en los campos médico y clínico. En consecuencia, existe una necesidad urgente de establecer métodos alternativos ecológicos para sintetizar nanopartículas9. Además, la síntesis de nanopartículas basada en microbios, económica y ecológica, ofrece limpieza, seguridad y solidez; además, las capacidades reductoras de los metabolitos microbianos pueden generar fácilmente nanopartículas monodispersas9.

El quitosano es un derivado desacetilado de la quitina, compuesto por un polisacárido lineal de residuos unidos (β1 → 4) de N-acetil-2 amino-2-desoxi-d-glucosa (glucosamina) y 2-amino-2-desoxi-d. -glucosa (N-acetil-glucosamina). Es biodegradable, soluble en un medio ácido acuoso mediante la protonación de amina primaria y los grupos amino libres generan una carga positiva en sus cadenas poliméricas14,15.

La renovación y el uso del quitosano han atraído un interés creciente en un campo diverso, por ejemplo, se describieron propiedades antimicrobianas de amplio espectro contra numerosos patógenos16. Curiosamente, el quitosano se utilizaba anteriormente para la síntesis de nanopartículas metálicas como agente reductor y/o estabilizante. Es más, el propio quitosano se ha utilizado durante mucho tiempo como material para producir nanopartículas de quitosano. La preparación natural de nanopartículas de quitosano (CNP) tiene varios atributos favorables, por ejemplo, biocompatibilidad, no toxicidad, biodegradabilidad y seguridad ambiental; además, las CNP tienen una alta permeabilidad a través de las membranas biológicas y, por lo tanto, son preferidas para una amplia gama de aplicaciones biológicas14,15 .

La metodología de superficie de respuesta (RSM) es un enfoque de modelado que proporciona una técnica estadística eficiente aplicada para optimizar las variables y el desempeño del proceso. RSM es rentable, reduce el número total de experimentos realizados para evaluar numerosas variables, es aplicable, identifica las condiciones óptimas y mantiene un alto nivel de precisión para obtener el mayor rendimiento en comparación con el método convencional17,18,19.

La red neuronal artificial (RNA) es la pieza central de la inteligencia artificial y una de las principales herramientas didácticas aplicadas en el aprendizaje automático20,21. Al igual que el cerebro humano, ANN es una herramienta avanzada que puede analizar y procesar datos, construyendo así de manera eficiente modelos computacionales con puntos (nodos) intercomunicados dentro de las capas ocultas. Este tipo de modelado permite aprender los patrones de datos y, por lo tanto, tomar decisiones precisas basadas en datos de investigación determinados. A través del modelado de ANN, se selecciona la arquitectura de la red y luego se construyen las capas ocultas con suficientes neuronas. Una red de este tipo inicia procesos de aprendizaje y capacitación hasta que comprende el patrón de datos. Finalmente, la validación y verificación del modelo ANN resultante tiene lugar antes de aprobar el modelo predictivo20,21.

El mecanismo de aprendizaje de ANN se basa en diagnosticar los diversos diseños en los datos para detectar cualquier diferencia y decidir qué patrón logra el objetivo; este proceso se controla mediante retropropagación inteligente que genera el modelo de resultado deseado que logra el objetivo. El procedimiento de aprendizaje profundo es supuestamente más veraz y puede sustituir eficazmente a las otras políticas de modelado20,21.

La pata negra y la pudrición blanda bacteriana causada por Pectobacterium carotovorum (perversamente llamada Erwinia carotovora) se encuentran entre las enfermedades más importantes que causan pérdidas económicas en las patatas y otros cultivos de hortalizas debido a la reducción del rendimiento y la calidad. La enfermedad de pudrición blanda también puede afectar a los tubérculos de papa en el suelo y almacenados22,23. Pectobacterium carotovorum es una bacteria necrotrófica agresiva, gramnegativa, que produce varias enzimas que degradan la pared celular de las plantas, incluidas pectinasas, poligalacturonasa, celulasas y proteasas, lo que provoca la maceración del tejido vegetal y síntomas de pudrición blanda24. La contaminación del tubérculo es la principal vía de propagación de la enfermedad debido a la capacidad de las bacterias patógenas de colonizar la superficie del tubérculo y permanecer asintomáticas25. La estrategia tradicional de manejo de la pudrición blanda se restringió al uso de bactericidas y antibióticos. Muchos de estos compuestos fueron prohibidos en los países desarrollados debido a sus peligros para los ecosistemas y la salud pública26. Por ello, existe un interés creciente en el desarrollo de nuevos métodos, como el uso de nanomateriales para limitar el uso de pesticidas.

No hay evidencia disponible sobre la conversión microbiana de quitosano en nanopartículas. Para cubrir tal abismo, se desarrolló un sistema microbiano único (Streptomyces microflavus) junto con ANN, como un enfoque de modelado novedoso, para optimizar los parámetros operativos de la biosíntesis de CNP. Se documentó la caracterización de las nanopartículas biofabricadas.

La nanotecnología reciente ha ocupado una situación única en la vida moderna, debido a sus características preferidas, especialmente cuando se aplica a sistemas biológicos. En comparación con los materiales a granel, las nanopartículas (NP) muestran comportamientos novedosos debido a su pequeño tamaño, diversas formas y variadas características ópticas, térmicas, eléctricas y mecánicas. Las nanopartículas orgánicas incluyen aquellas que se fabrican a partir de componentes orgánicos como proteínas, carbohidratos, lípidos, polímeros como el quitosano y cualquier otra sustancia orgánica. Normalmente, estas NP son biodegradables y no tóxicas27. El posible campo de aplicación de las NP orgánicas está determinado por diferentes criterios, incluida la composición, la forma de la superficie, la estabilidad, la capacidad de carga y otros27.

Se establecieron varios protocolos para la fabricación de nanopartículas. Los enfoques físicos y químicos, así como los procedimientos de mezcla, utilizan estabilizadores y reductores altamente concentrados que son perjudiciales tanto para el medio ambiente como para la salud humana. El procedimiento de base biológica ha surgido con varias ventajas. La técnica es un proceso de un solo paso y, por lo tanto, es amigable con el medio ambiente, no es tóxico y requiere menos energía; además, el producto de base biológica tiene mayor estabilidad28. La síntesis de nanopartículas basada en fábricas microbianas resultó superior a otros métodos. La mayor parte de la biofabricación de nanopartículas se limita a iones metálicos y no se han establecido descripciones de la biofabricación de CNP sobre bases microbianas. Sin embargo, las técnicas de fábrica microbiana siguen los principios de la química verde y las nanopartículas de quitosano biosintetizadas son estables, no tóxicas y libres de compuestos químicos potencialmente dañinos29,30.

Se analizó un total de diez cepas de actinomicetos morfológicamente diferentes para determinar su potencial para la biosíntesis de nanopartículas de quitosano. Entre estos aislados, 5 aislados exhibieron una capacidad obvia para biosintetizar CNP. De ellos, el aislado más prometedor Streptomyces sp. Se seleccionó la cepa NEAE-83 para estudios adicionales. Ningún esfuerzo previo, según el conocimiento de los autores, ha descrito la síntesis de CNP por Streptomyces sp. cepa NEAE-83. En el estudio actual se informó sobre un proceso pionero de biofabricación de CNP utilizando un Streptomyces sp. cepa NEAE-83.

El patrón de fabricación bacteriana de los CNP se verificó y examinó en los espectros UV/VIS de 200 a 400 nm (Fig. 1A). Las características ópticas del biopolímero de CNP generado exhibieron un pico severo solitario con la mayor absorbancia a 310 nm. La Figura 1B,C muestra tres viales de quitosano: Streptomyces sp. cepa NEAE-83 sobrenadante y los CNP, así como las nanopartículas después de la extracción y el secado.

(A) Espectros UV/visible de quitosano (línea azul) y nanopartículas de quitosano (línea roja), (B) Viales de solución de quitosano (B1), filtrado de cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus (B2) y nanopartículas de quitosano biosintetizadas (B3 ), y (C) nanopartículas de quitosano desecadas biosintetizadas utilizando la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus.

La absorbancia de un solo pico a 310 nm de CNP de Streptomyces sp. La cepa NEAE-83 en la región UV se encuentra dentro del rango informado anteriormente de 285 nm30 y 320 nm15. El espectro UV/visible de los CNP se considera un indicador del éxito del proceso de biosíntesis, donde es nítido en los CNP, pero tiene una banda de absorción más amplia en el quitosano15,30.

El actual Streptomyces sp. La cepa NEAE-83 ha sido completamente clasificada en función de su cultivo, morfología, características de fisiología celular y secuencia de ARNr 16S. Era inmóvil, aeróbico y formaba un micelio de sustrato largo y bien desarrollado. El reverso de la colonia era marrón y el color del micelio era gris sin pigmentos difusibles (Fig. 2A). La morfología colonial fue consistente con el género Streptomyces31,32.

(A) Micelio coloreado de Streptomyces sp. cepa NEAE-83. cultivado en medio agar extracto de levadura-extracto de malta. (B) Zona de aclaramiento de almidón hidrolizado por Streptomyces sp extracelular. amilasas de. (C) Coagulación y peptonización de la leche.

La micrografía electrónica de barrido (Fig. 3) muestra que los micelios vegetativos aéreos son abundantes y están bien desarrollados y las hifas aéreas son largas. Se pudo notar que las hifas aéreas se distinguían en cadenas de esporas Rectiflexibiles que portaban más de 30 esporas con superficie lisa, que medían 0,33 ± 0,04 × 0,89 ± 0,10 µm. Las esporas aéreas son alargadas.

La ornamentación de la morfología de la cadena de esporas y la superficie de las esporas de Streptomyces sp. cepa NEAE-83 con un aumento de × 9500 (A) y × 16 000 (B), según se detecta mediante micrografía electrónica de barrido.

Los datos de la Tabla 1 muestran las características fisiológicas de Streptomyces sp. cepa NEAE-83. La coagulación de la leche, la peptonización, la hidrólisis del almidón, la licuefacción de la gelatina, la proteasa, la uricasa, la celulasa y la quitosanasa fueron positivas, pero la L-asparaginasa, la reducción de nitratos, el pigmento melanoide y la producción de H2S fueron negativas. El desarrollo microbiano óptimo se produjo entre 30 y 37 °C y un pH de 7, con una tolerancia al NaCl de hasta el 3 % (p/v). No se detectaron pigmentos difusibles. Estos criterios de identificación siguen en su mayoría los del género Streptomyces2,31,32. Otro, el Streptomyces sp. La cepa NEAE-83 no mostró actividad antimicrobiana contra todas las bacterias y cepas de hongos Gram positivas y Gram negativas analizadas.

El árbol filogenético de unión de vecinos (Fig. 4B), construido a partir de la secuencia del gen 16S rRNA (1214 pb), muestra las asociaciones entre Streptomyces sp. cepa NEAE-83 y especies interrelacionadas del género Streptomyces en el GenBank. El análisis del árbol filogenético especificó que Streptomyces sp. La cepa NEAE-83 pertenece a un clado junto con la cepa X52 de Streptomyces microflavus (n.º de acceso de GenBank/EMBL/DDBJ MT878548.1), la cepa G7 de Streptomyces microflavus (n.º de acceso de GenBank/EMBL/DDBJ MT355851.1), la cepa MPPS14 de Streptomyces fulvissimus (N.º de acceso GenBank/EMBL/DDBJ MT973973.1), cepa U25 de Streptomyces fimicarius (n.º de acceso GenBank/EMBL/DDBJ MT355869.1) y cepa L18 de Streptomyces lavendulae (n.º de acceso GenBank/EMBL/DDBJ MT355862.1).

El esquema de la electroforesis en gel de agarosa de las bandas del producto de PCR del fragmento 16S amplificado (1214 pb) obtenido de Streptomyces sp. cepa NEAE-83 (MG384964) (A) y el árbol filogenético de unión vecina (B).

Según el estudio de la secuencia de ARNr 16S de Streptomyces sp. cepa NEAE-83, junto con sus características morfológicas y fisiológicas, Streptomyces sp. La cepa NEAE-83 se clasificó como cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus. La cepa se depositó en el Genbank y el número de acceso se obtuvo como MG384964.

Tras la selección de la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus y la garantía de su eficacia en la bioconversión de quitosano a granel en CNP, este último se investigó mediante varios procedimientos de caracterización.

La investigación de los CNP mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) mostró detalles sobre el tamaño y la construcción morfológica de la superficie. Los CNP muestran partículas de tipo esférico (Fig. 5A), con uniformidad y homogeneidad, sin ninguna aglomeración visible. La imagen de la estructura morfológica generada por microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostró el tamaño de los CNP en un rango de 60 a 70 nm, sin agregación ni aglomeración (Fig. 5B). SEM y TEM se armonizaron en la identificación de CNP. Tanto SEM como TEM son herramientas eficaces para descubrir nanopartículas y herramientas ampliamente aceptadas para el examen de la formación morfológica, por ejemplo, forma, tamaño y área de superficie33.

Las nanopartículas de quitosano biosintetizadas utilizando la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus, según lo detectado por las micrografías de SEM (A), TEM (B) y EDXS (C).

Las partículas esféricas obtenidas en este estudio coincidieron con las formas esféricas u ovaladas de la mayoría de las preparaciones de CNP34,35. Además, los CNP bien dispersos y entrelazados observados conducen a la creación de una mayor superficie, lo que sugiere que los CNP son adecuados para procesos que dependen de criterios de adsorción36.

Los CNP que tienen un tamaño de partícula pequeño (60-100 nm) y una gran superficie podrían ser esenciales para una amplia variedad de aplicaciones, incluidos los tejidos37. El tamaño de partícula de las nanopartículas de quitosano tiene un impacto significativo en las propiedades de estas partículas cuando se utilizan en aplicaciones farmacéuticas. Un tamaño de partícula más pequeño tiene el potencial de encapsular una mayor cantidad de sustancias terapéuticas, mejorar la estabilidad y biodisponibilidad del fármaco y posibilitar su administración por un período de tiempo más prolongado38. Chandrasekaran et al.39 propusieron que el área superficial aumenta a medida que disminuye el tamaño de las partículas. Éste podría ser el factor determinante en el aumento de la actividad antibacteriana de las nanopartículas de pequeño tamaño.

A diferencia de los materiales a granel, la imagen actual del CNP muestra la no aglomeración. Aunque varias nanopartículas pueden tener una fuerza iónica alta que causa agregación y aglomeración en la fase acuosa, los CNP sintetizados por la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus no mostraron agregación ni aglomeración. Existe una clara variación entre ellos. La agregación describe partículas fuertemente unidas o incluso fusionadas, mientras que la aglomeración revela partículas débilmente unidas; sin embargo, se puede aceptar incluso una pequeña aglomeración de CNP40.

Los tipos, distribuciones y concentraciones de elementos en CNP se exploraron utilizando EDXS mediante TEM (Fig. 5C). Los espectros EDXS de CNP confirman la existencia del componente elemental principal del quitosano nativo (carbono, nitrógeno y oxígeno). Durante el proceso de fabricación, los CNP pueden estar sujetos a cambios en la estructura, por lo que EDXS puede ayudar a detectar cualquier variación. Donde la capa interna del átomo es golpeada por un rayo de electrones TEM, en el que su electrón es desplazado por otro electrón de la capa externa para llenar la posición vacía. Este proceso conduce a una variación de la energía en forma de rayos X; la intensidad de los rayos X está directamente relacionada con la concentración y es única para cada elemento41.

En este estudio se investigó la distribución del tamaño de partículas de la suspensión de nanopartículas de quitosano utilizando un analizador de tamaño de partículas (PSA). La distribución de tamaños se determinó a temperatura ambiente e incluyó un rango de longitud de onda de 1 a 760 nm. La medición del analizador de tamaño de partículas de una muestra de nanopartículas de quitosano reveló un pico estrecho y agudo a 36,6 nm de diámetro en θ = 90 ° y 150,2 nm en θ = 11,1 ° como se muestra en la Fig. 6A. Los tamaños registrados por el analizador de tamaño de partículas sólo pueden tomarse como un valor relativo y no pueden compararse con el determinado por microscopía electrónica42. La microscopía electrónica es capaz de detectar las dimensiones geométricas de las partículas dadas midiendo el ancho de las partículas individuales de la imagen y determinando su forma y estructura superficial (por ejemplo, textura)43,44. Las imágenes se vieron favorecidas por su visualización de partículas de alta resolución y el efecto mínimo de los artefactos en la determinación del tamaño44.

Análisis de nanopartículas de quitosano con (A) PSA y (B) potencial ζ para biosintetizarlas con la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus.

Se investigaron los CNP biosintetizados para determinar el valor del potencial ζ. El potencial ζ representado (Fig. 6B) muestra que la dispersión tiene un único pico, que representa una brillante uniformidad de los CNP, que tenían una carga positiva con un potencial ζ de + 35,6 mV, lo que confirma la presencia de grupos amina protonados en la superficie. El valor actual del potencial ζ sugiere una buena estabilidad de los CNP biofabricados.

El análisis del potencial ζ es una forma única de explorar las características de las dispersiones coloidales. El potencial zeta puede tener un impacto significativo en la estabilidad de las partículas en suspensión debido a la repulsión electrostática que existe entre las partículas individuales45. Yien et al.46 informaron que el potencial zeta de las nanopartículas de quitosano oscilaba entre + 22 y + 55 mV y su efecto inhibidor estaba influenciado por el tamaño de las partículas y el potencial zeta de las nanopartículas de quitosano. Kheiri et al.47 revelaron que los potenciales zeta de las superficies de los CNP tienen una carga positiva de aproximadamente 45,6 mV. Según los hallazgos de Khan et al.48, Raza y Anwar49 y Asal et al.50, se determinó que el potencial zeta en la superficie de los CNP era + 31 ± 3,14, + 31,3 y + 31 ± 2,2 mV; respectivamente. Por el contrario, Qi et al.51 informaron que las superficies de las nanopartículas de quitosano tenían una carga positiva de aproximadamente 51 mV. Por otro lado, Iswanti et al.52 informaron que las superficies de las nanopartículas de quitosano tenían una carga superficial positiva de + 3,3 ± 0,4 mV. A pesar de que la suspensión es físicamente estable, Manikandan y Sathiyabama53 mencionaron que es necesario un potencial zeta de al menos ± 30 mV como mínimo para que una suspensión de NP se estabilice principalmente mediante repulsión electrostática. Si el potencial zeta es menor que + 30 mV, esto indica que los CNP tienen menos estabilidad debido a una menor repulsión electrostática54. Otra ventaja, el potencial ζ positivo, puede considerarse otra ventaja, es decir, como agente antimicrobiano. El potencial ζ positivo de las partículas permite interactuar fácilmente con las cargas negativas de la membrana celular y el ADN, que luego se liberan en el citoplasma55.

Se llevó a cabo un análisis de mapeo para observar más de cerca los comportamientos de la comunidad CNP. El análisis de mapeo actual de las respuestas individuales de las nanopartículas se llevó a cabo para investigar el patrón de ubicaciones y distribución del nanomaterial elemental (Fig. 7). Los datos recuperados de la microscopía electrónica muestran la imagen completa de la distribución de CNP que se distribuyeron uniformemente. Sin embargo, los elementos individuales O, C y N de los CNP tienen el mismo patrón, donde están dispersos y distribuidos uniformemente.

Análisis de mapeo de nanopartículas de quitosano biosintetizadas utilizando la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus.

Se llevó a cabo un análisis FTIR para detectar la posible incidencia de diferentes grupos funcionales de unión con CNP debido a la acción de estabilización y reducción del sobrenadante de la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus. Se analizó el espectro FTIR de los CNP biosintetizados y se comparó con el espectro FTIR de un estándar de quitosano (Fig. 8A, B). El primer grupo de bandas apareció en los espectros entre 4057 y 3750 cm-1, indicando la combinación de grupos funcionales de –NH2, –CH, C–C y –OH.

Examen de FTIR para las nanopartículas de quitosano biosintetizadas (A), para el estándar de quitosano (B) y XRD (C) de CNP fabricados con la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus.

Los cambios significativos de los picos en el espectro de CNP con respecto a los picos en el espectro del estándar de quitosano indican un papel importante de los grupos funcionales en la biosíntesis de CNP. La presencia de bandas a 3442 cm-1 en la muestra estándar de quitosano indica un fuerte estiramiento del OH dimérico56. Además, en la formación de nanopartículas, el pico de estiramiento del hidroxilo (OH) a una longitud de onda de 3442,09 cm-1 encontrado en el espectro del estándar de quitosano se desplazó a 3326,66 cm-1, lo que indica las vibraciones de estiramiento de los grupos OH (Fig. 8A, B). Una banda a 3420 cm-1 se atribuye a picos combinados de grupos –OH y –NH2 que estiran la vibración en el quitosano57. El grupo de estiramiento alifático (CH y CH2) apareció a 2929 cm-1. A 2381–2129 cm−1 han surgido las vibraciones de estiramiento de C=C conjugado y C≡C.

Krishnaveni y Ragunathan56,58 informaron que las bandas en 1655 cm−1 y las de 1641, 1642 cm−1 indican la presencia de la región amida I. Además, la banda a 1654,98 cm-1 (alrededor de 1655 cm-1) indica la vibración de estiramiento de la amida tipo I. El intenso pico de la región de amida I cambió de 1654,98 cm-1 en el espectro FTIR del estándar de quitosano a 1641,48 cm-1 en el espectro FTIR de CNP, lo que indica interacciones entre los grupos amina protonados del estándar de quitosano con los componentes del filtrado del cultivo. de Streptomyces microflavus cepa NEAE-83. En las nanopartículas de quitosano, este pico es más nítido y se desplaza hacia 1641,48 cm-1, lo que indica un aumento de interacciones o enlaces. Entonces, el cambio de vibraciones de números de onda más altos a más bajos revela la formación de CNP57.

El pico alrededor de 1558 cm-1 en el espectro FTIR de CNP se debe a las vibraciones de estiramiento de la Amida II (CONH2)57. El espectro de CNP mostró una banda de alrededor de 1412 cm-1 que indica un estiramiento aromático C-C57. En el espectro FTIR del estándar de quitosano, la presencia de la región Amida III se indicó mediante una banda a 1381 cm-157. Las bandas en 1381, 1320 y 895 cm-1 desaparecieron en el espectro FTIR después de la biosíntesis de CNP, lo que revela que estos grupos están involucrados en la biosíntesis de CNP mediante el filtrado de cultivo de la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus. La absorción en el número de onda alrededor de 1076 cm-1 se produce a partir de la vibración elástica de los grupos CO (COH y COC) en el puente de oxígeno, que surge de la desacetilación del quitosano. Los pequeños picos ubicados al final de los espectros FTIR corresponden al movimiento de la estructura sacárida del quitosano45,59.

El análisis FTIR declara la aparición de grupos de protección en la superficie de los CNP, lo que estabiliza los CNP y previene su coagulación y/o agregación en la fase coloidal.

XRD se utilizó para explorar la construcción cristalográfica de CNP. El patrón de XRD se utiliza en la ciencia de materiales como un procedimiento rápido y primario para la detección de fase de la cristalinidad para brindar suficiente perspectiva sobre los aspectos unitarios. Como consecuencia de esto, se ha designado XRD como huella digital de una sustancia específica. La irradiación de rayos X provocó distintos ángulos de dispersión e intensidades del rayo.

El patrón XRD de la muestra de CNP mostró seis picos distintivos en 2θ que estaban en 11,38, 16,44, 18,27, 22,86, 24,13 y 26,17° (Fig. 8C), lo que indica un cambio con respecto a los picos normales de quitosano. Rasaee et al.59 informaron que los CNP exhibieron picos de difracción en 2θ = 10° (pico de difracción débil) y 20° (pico de difracción fuerte), lo que revela que el quitosano tenía un alto grado de cristalinidad. El espectro XRD de CNP indica el cambio de pico con respecto a los picos normales del quitosano natural, que corresponde a la reducción de la cristalinidad y al aumento de la estructura amorfa. La estructura amorfa de los CNP contribuye a una mayor capacidad de sorción45,60.

Las propiedades termoanalíticas de los CNP generados bacterianamente se probaron en un rango de temperatura controlado, empleando dos métodos principales: análisis termogravimétrico (TGA) y calorimetría diferencial de barrido (DSC). Dado que las propiedades termoanalíticas de las nanopartículas participan en procesos químicos. La principal distinción entre TGA y DSC es la técnica utilizada para cuantificar los cambios en las muestras causados ​​por el calor35,60,61.

Se realizó TGA para rastrear el comportamiento térmico de los CNP como consecuencia de una fluctuación continua en la relación de calentamiento (de 25 a 500 °C) para explorar la fluctuación de masa en las características físicas y químicas de los CNP con el cambio de temperatura (Fig. 9A). . TGA demostró que desde 32,73 hasta 60,90 °C, se puede detectar fácilmente una rápida caída de masa inicial (-3,756%). A temperaturas más altas, se observaron pérdidas de peso de CNP con descomposición en múltiples etapas. El rango de temperatura de 205,92 a 355,80 °C registró la mayor pérdida de peso (- 28,683%), que fue de 1,474 mg, mientras que la pérdida de peso más baja (- 1,051%) se midió en un rango de 483,73 a 499,90 °C.

Cromatogramas de la investigación TGA (A) y DSC (B) de CNP fabricados con la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus.

TGA determina el análisis térmico diferencial determinando la relación entre la alteración en la cantidad de la muestra y diferentes temperaturas, o como una temperatura fija en un tiempo y pérdida constante de masa35,60,61. Comúnmente, la temperatura al inicio del TGA causa sequedad de los CNP y puede causar fácilmente una rápida caída de masa de CNP debido a la pérdida de agua unida ubicada en los dos grupos polares; este cambio de secado no resulta en reacciones químicas ni conduce a cualquier alteración estructural60. Otra razón para la caída de peso inicial podría ser la descomposición de unidades volátiles, la deshidratación de los anillos de sacáridos y la despolimerización36. Posteriormente, a medida que aumenta la temperatura, pueden ocurrir pérdidas secuenciales de peso de CNP debido a la sublimación y/o evaporación. Sin embargo, a temperaturas más altas, se pudo observar una descomposición en múltiples etapas debido a la degradación térmica de los CNP en forma de patrones escalonados61.

Aunque las fases de TGA no interfirieron durante el comportamiento dinámico como se ve en el gráfico, existe una posible interferencia de descomposición invisible, que requiere una clasificación de calor mucho más baja o el uso de enfoques de TGA paso a paso. Como resultado, el TGA por sí solo puede no ser suficiente para detectar los productos destruidos; en consecuencia, la DSC es frecuentemente esencial además de la TGA para determinar la presencia de productos destruidos intermedios35.

La investigación termoanalítica del DSC se realizó a varias velocidades de calentamiento para aclarar la cantidad (positiva o negativa) de variación en el flujo de calor de los CNP como resultado de la temperatura en la aparición del solvente como referencia. Se recopiló información termoanalítica tanto para los CNP como para la referencia de solvente para producir un esquema de fases (Fig. 9B). Con el cambio en el sistema termodinámico, se detectaron transiciones de dos fases de CNP con ciertos picos endotérmicos amplios. Se identificó un pico a 117,22 °C en el rango de 81 a 140 °C, lo que requirió −199,95 J de calor por gramo de CNP. A 253,95 °C, surgió otro pico, lo que resultó en 35,30 J de calor por gramo de CNP. A 229 °C se detectó una única fase de transición vítrea de los CNP.

El DSC se utilizó para calcular el flujo de calor requerido o liberado versus el cambio de temperatura en un momento específico. El análisis térmico mostró cierta pérdida de peso en las etapas avanzadas debido a la descomposición de los CNP. Sin embargo, las nanopartículas producidas por la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus no se desintegraron completamente a altas temperaturas (500 °C) y demostraron cierta constancia en la estructura del polisacárido, lo que podría atribuirse a la elevada característica de reticulación de los CNP, que procedimientos una red más robusta y firme del hidrogel36,60,61.

Se resaltaron las transiciones de fase del mecanismo de degradación térmica para cada paso. La configuración de DSC está planificada para permitir la temperatura de mantenimiento lineal de una muestra en función del tiempo. Así, se pueden rastrear los fenómenos físicos de un material, como la constancia térmica, la pureza y la transición vítrea35.

El primer pico endotérmico se generó a baja temperatura debido a la eliminación de agua. Luego surgió un amplio pico endotérmico a 253,95 °C debido a la ruptura del entrecruzamiento de los CNP. Además, se encontró una sola transición vítrea (la fase en la que el material pasa de un estado duro y frágil a uno blando y gomoso) en las curvas de calentamiento DSC a alta temperatura (229 °C), esto se debe a la existencia de una temperatura extrema. constancia térmica de la reticulación, lo que demuestra la consistencia de los CNP36. La reducción de la cristalinidad de los CNP después de la transformación puede deberse a alteraciones en la formación de estado sólido del quitosano causadas por la reticulación y, por lo tanto, la degradación del CNP ocurre por encima de 300 °C60.

Todas las especificaciones anteriores proporcionan una perspectiva precisa para caracterizar los CNP y coincidieron entre sí y con trabajos anteriores. Además, se cree que el método microbiano propuesto actualmente es ideal para producir CNP de alta calidad.

Descubrir los mejores entornos para la biosíntesis extrema de CNP mediante la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus es el objetivo principal de la política de optimización del ensayo. El proceso de biofabricación de la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus se optimizó y modeló basándose en la técnica avanzada de RSM, luego se aplicó un enfoque de inteligencia artificial. Se generaron y compararon los modelos de predicción de ambos enfoques, como un procedimiento sin precedentes en este campo.

Se utilizó el enfoque de modulación estadística de RSM para establecer una matriz de cuatro factores de CCFCD para explorar la combinación máxima, así como los efectos de las variables individuales, de interacción y cuadráticas de los factores independientes probados en la biosíntesis de CNP por la cepa NEAE de Streptomyces microflavus. 83. La matriz de diseño y los niveles (reales y codificados) de las cuatro variables probadas, así como los valores de CNP investigados y previstos y sus errores residuales se presentan en la Tabla 2. Las pruebas mostraron diversos grados de respuestas que alcanzaron hasta 9,41 mg. /mL (ensayo 27).

Con base en los datos obtenidos del CCFCD, se compararon los modelos lineal, de interacción de dos factores y cuadrático para elegir el modelo que mejor se ajusta (Tabla 3). La comparación de las estadísticas del modelo, como la falta de ajuste, y la suma de cuadrados, concluyó que el modelo cuadrático era la opción ideal, registrando un error de falta de ajuste insignificante para el valor de probabilidad (P > 0,05), mientras que el valor P del modelo fue significativo. . Tanto la suma de cuadrados del error de predicción (PRESS) como la desviación estándar fueron menores en comparación con los otros modelos. Finalmente, el modelo cuadrático tuvo valores más altos de coeficiente de determinación (R2), R2 ajustado y R2 previsto. Por lo tanto, se eligió el modelo cuadrático para el proceso de biofabricación de CNP por moldeo. Al utilizar el modelo cuadrático creado con el CCFCD, se encontró que los valores predichos de CNP estaban en línea con los reales (Tabla 2).

El modelo CCFCD cuadrático se seleccionó en función de la efectividad de cada modelo. El valor de P más bajo (<0,05) fue confiablemente significativo para el proceso de modelado de biofabricación de CNP. Otro criterio de elección importante es R2. El valor R2 indica hasta qué punto los parámetros experimentales pueden explicar los valores de respuesta observados62. Si R2 es 0,9 o mayor, el modelo se considera adecuado y más preciso para predecir la respuesta63,64. Generalmente, cuanto más cerca de 1, mayor es la capacidad de modelización de los datos18. El modelo cuadrático actual tiene valores de R2, R2 ajustado y R2 previsto que en realidad están cerca de uno. El cambio en la respuesta experimental de los CNP da como resultado la variación en la cantidad de uno o varios factores que se conoce como valor R2, que siempre oscila entre cero y 1 para todos los tipos de R262. Sorprendentemente, independientemente de la importancia de los factores, aumentar el número de predictores (factores) conduce a un aumento constante del valor R2. Como resultado, el R2 ajustado es una versión modificada del R2 que tiene en cuenta la cantidad de factores del modelo. A diferencia de R2, el R2 ajustado cambió sabiamente al agregar factores adicionales al modelo. Como resultado, el R2 ajustado es un mejor indicador que el R2 para determinar la aptitud del modelo. Finalmente, el R2 previsto se emplea para evaluar el potencial predictivo del modelo, como predecir el valor de los CNP en nuevos niveles no probados de los factores. Los valores de R2 previsto y R2 ajustado deben estar dentro del 20% entre sí, lo que indica que el modelo es muy significativo y preciso, así como una concordancia razonable entre ellos65. Los valores predichos de CNP calculados con base en el modelo cuadrático de CCFCD fueron muy cercanos a los experimentales; en consecuencia, los residuos o errores fueron bajos, lo que representa otra evidencia de la precisión del modelo. En consecuencia, se omitieron los modelos lineal y de interacción de dos factores, y se eligió el modelo cuadrático como el mejor ajustado para el bioprocesamiento de CNP por la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus.

Los datos recuperados del CCFCD se expusieron a análisis de varianza y regresión múltiple (ANOVA) (Tabla 4). El modelo general tuvo un rendimiento significativo con un valor de P <0,05. Todos los términos del modelo, incluidos los efectos de los términos cuadráticos, de interacción y lineales, siguieron una tendencia significativa similar, excepto la interacción de dos factores del pH inicial y la concentración de quitosano, así como el efecto cuadrático tanto del pH inicial como de la concentración de quitosano. El error de falta de ajuste del modelo no alcanzó el umbral de significancia, registrando un valor P más alto de 0,1801. Además, la desviación estándar del modelo, el coeficiente de variación y la precisión adecuada mostraron un rendimiento decente.

El valor P bajo, junto con el valor F alto y la falta de ajuste no significativa indicaron la importancia del modelo general sugerido. El valor P se utilizó como herramienta de diagnóstico para medir la importancia tanto del modelo como de los factores. Se consideró que las variables de proceso con valores de P ≤ 0,05 tenían efectos significativos en la respuesta66. Además, la mayoría de los términos probados son significativos (P < 0,05), lo que representa la importancia de los parámetros probados para la biofabricación de CNP y sugiere además que las variables, con sus niveles y CCFCD, están bien especificadas y funcionan de manera óptima para el proceso. Fabricación microbiana de CNP.

La relación señal-ruido se mide mediante el valor de precisión adecuado; se desea un valor mayor que 4 e indica un fuerte ajuste del modelo66. La relación de precisión adecuada es superior a 4, lo que indica que el espacio de diseño del modelo es fructífero para maximizar la biosíntesis de CNP en los diversos rangos probados de los factores. Otro elemento de confiabilidad fue el valor menor del coeficiente de variación% (CV%), que es deseable para la confiabilidad del modelo. El valor muy bajo de CV% indica una mayor precisión de los experimentos realizados63. Además, los tres tipos de R2 son suficientemente altos para respaldar la importancia tanto del modelo como de sus variables. Tanto el R2 ajustado como el R2 previsto estaban en armonía. Para estar en un acuerdo razonable, ambos tipos de R2 no deben ser más del 20% entre sí18,67, lo que indica una alta compatibilidad entre los valores de prueba y predichos de los CNP biosintetizados y, además, significa la capacidad predictiva del modelo razonable dentro del espacio de diseño. Además, la estimación del coeficiente reveló una variedad de efectos positivos y negativos. Los coeficientes negativos de algunos términos del modelo indican el impacto antagónico en concentraciones más altas16; dicha variable tiene un impacto en la construcción microbiana de los CNP. Mientras que un valor de coeficiente positivo designa un impacto cooperativo, y el alto nivel de la(s) variable(s) aumenta la biosíntesis de CNP dentro del área de diseño.

Para determinar la idoneidad del modelo, se investigó la idoneidad trazando la predicción versus los puntos reales (Fig. 10A). Los puntos del análisis de regresión están ubicados mucho más cerca de la línea de predicción perfecta y muestran un mejor ajuste de los valores predichos del modelo y los resultados experimentales, lo que confirma la precisión del modelo5.

Los valores predichos versus reales (A) y (B) los residuales versus los valores predichos de la biosíntesis de nanopartículas de quitosano utilizando la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus.

De manera similar, se trazaron los valores residuales estudentizados externamente del modelo versus el predicho (Fig. 10B). El gráfico muestra una dispersión equivalente de los puntos residuales alrededor del eje 0; es más, se encontró que los puntos residuales estaban cerca del eje 0 sin linealidad. El gráfico mostró que los valores residuales estudentizados externamente se dispersan aleatoriamente alrededor del eje 0, lo que sugiere que la varianza de los resultados experimentales es constante para todos los valores68. Este patrón de distribución es lo suficientemente perfecto como para respaldar la aplicabilidad del modelo CCFCD. En consecuencia, la varianza de los datos de los CNP y el proceso de biosíntesis fueron independientes, lo que demuestra la adecuación y generalización del modelo. Como resultado, estas dos pruebas de suficiencia también validan el diseño y los puntos de datos.

Para investigar el impacto dual de cada par de factores en la biosíntesis de CNP utilizando la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus, se construyeron los gráficos de la superficie tridimensional (3D) de los cuatro factores independientes (Fig. 11). La biosíntesis máxima de CNP se situó en la concentración baja de quitosano con un valor de pH alto (Fig. 11A), la temperatura de incubación alta con un pH inicial alto (Fig. 11B), un pH inicial alto con un período de incubación bajo (Fig. 11C), un pH bajo y un período de incubación bajo (Fig. 11C). concentración de quitosano con temperatura de incubación alta (Fig. 11D), concentración de quitosano baja con período de incubación bajo (Fig. 11E) y período de incubación bajo con temperatura de incubación alta (Fig. 11F). Fuera de estos rangos, la biosíntesis de CNP disminuyó drásticamente. En el análisis de los gráficos 3D se pudo observar una estrecha relación entre cada par de factores probados. Esto significa que los rangos de los factores se eligieron sabiamente y que el modelo es el más apropiado para el diseño. En consecuencia, la mayor combinación de los probados en términos del nivel codificado se estimó basándose en la función de predicción del siguiente modelo CCFCD:

donde X1; pH inicial, X2; concentración de quitosano (%), X3; temperatura (°C), X4; período de incubación (h).

Gráfico de superficie tridimensional del impacto interactivo de cada par de factores para la biosíntesis de nanopartículas de quitosano por la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus. Los demás factores se mantuvieron en el nivel central.

Los datos del CCFCD se sometieron a procedimientos de modelado más avanzados, es decir, el enfoque basado en inteligencia artificial (Tabla 2) mediante aprendizaje automático. Se desarrolló un modelo predictivo de ANN. Se creó una plataforma ANN de alimentación directa multicapa completamente conectada para modelar la biosíntesis de CNP por parte del actinomiceto candidato.

A pesar de que la inteligencia artificial se ha abierto camino en la investigación científica reciente, no se informó sobre ningún trabajo sobre la modulación de la biofabricación de CNP por parte de ANN. Este es el primer trabajo que demuestra la viabilidad de este tipo de modelado. Como resultado, se propuso la inteligencia artificial como posible modelo para los datos experimentales del CCFCD.

Se estableció la estructura arquitectónica más fina, se probaron numerosas capas ocultas y neuronas dentro de cada capa oculta en numerosos patrones de factores específicos de ANN. El aprendizaje automático continuó hasta que los valores de error, es decir, la desviación absoluta media (MAD), la suma de errores cuadráticos (SSE) y el error cuadrático medio (RMSE), alcanzaron su mínimo, complementado con el valor máximo de R2, para ambos entrenamientos. y puntos de validación (Tabla 5). Se realizaron numerosas pruebas de aprendizaje, de 5000 recorridos cada una, por lo que se encontró que los parámetros óptimos de ANN estaban en una tasa de aprendizaje de 0,1, lo que implicaba el procedimiento de retención en una proporción de 0,2. La función de activación operada en los nodos de las capas ocultas fue la tangente sigmoidea hiperbólica (NTanH).

Se descubrió que la topología de ANN en tales condiciones funciona mejor cuando tiene una capa de entrada compuesta por cuatro neuronas (factores independientes), una capa de salida de una neurona (biosíntesis de CNP) y una capa oculta intermedia con 20 neuronas. ; (NTanH (20). En consecuencia, la mejor estructura arquitectónica de la topología ANN se generó como 4-20-1 (Fig. 12).

La red neuronal artificial final de la biosíntesis de CNP por la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus. El esquema de arquitectura muestra una capa de entrada (4 neuronas), una capa oculta (20 neuronas) y una capa de salida con una sola neurona.

La ANN es lo suficientemente flexible como para generar modelos eficientes y precisos a partir de cualquier tipo de superficie de respuesta, utilizando capas y nodos ocultos adecuados. La plataforma ANN emplea un algoritmo de aprendizaje automático que predice variables de respuesta utilizando una función flexible. La función de activación ayuda a la ANN a aprender pesos y mapear la compleja relación no lineal, incluso si no existe una relación aparente entre las variables de entrada y salida, es por eso que la ANN puede predecir y ajustar datos muy bien modelando diferentes superficies de respuesta. utilizando la arquitectura adecuada y capaz de aprender cualquier función no lineal de manera flexible y precisa20,21,69.

La plataforma de red neuronal actual (4-20-1) emplea un algoritmo de aprendizaje automático, denominado perceptrón multicapa totalmente conectado. Vale la pena mencionar que las ANN tienen una capa intermedia en lugar de una ruta directa entre los factores de entrada y la variable CNP de salida.

Las capas intermedias (ocultas) desempeñan un papel central en la gestión de una correlación única entre entradas y salidas, en lugar del camino directo; por lo tanto, la RNA se considera un predictor excepcional cuando la forma de relación entre la(s) respuesta(s) y las entradas no es requerida o no es reconocible20,21,69. La función de activación de RNA empleada en los nodos de la capa oculta se encarga de descubrir dichas combinaciones lineales de las variables individuales, sin designar la relación entre la(s) entrada(s) y la respuesta20,21,69.

Sobre la base de dicho modelo, se estimaron los valores predichos de ANN para cada punto de datos experimental (Tabla 2). En consecuencia, los valores predichos de ANN muestran una armonía más sensible con los del ensayo y sus residuos mostraron valores menores que los obtenidos por el modelo CCFCD.

Los valores predichos de ANN se compararon con los valores reales (Fig. 13). El análisis de regresión lineal demuestra puntos de ajuste mejorados en relación con los reales. Los puntos se sitúan más cerca de la línea de previsión perfecta tanto para el proceso de entrenamiento como para el de validación, avalando la idoneidad del modelo.

Biosíntesis de nanopartículas de quitosano versus los valores predichos de ANN y los valores residuales utilizando la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus para procesos de entrenamiento y validación.

El gráfico de análisis de residuos muestra una dispersión de los datos residuales por encima y por debajo de la línea de regresión. El análisis de residuos mostró también una dispersión normal de los residuos. Este patrón es lo suficientemente perfecto como para respaldar la idoneidad del modelo ANN.

En comparación con el modelo CCFCD, el modelo ANN tiene puntos predictivos altos con residuos más bajos (Tabla 2), donde la regresión lineal y el análisis residual muestran que los puntos del modelo ANN (Fig. 13) están ubicados mucho más cerca de la pendiente de la mejor pronóstico que los puntos del modelo CCFCD (Fig. 10). Esto concluye que la RNA puede ajustarse a los datos reales de la investigación con precisión y con una mayor capacidad predictiva. Por tanto, la capacidad de generalización del modelo ANN supera al modelo CCFCD.

La precisión del modelo para predecir la biosíntesis de CNP microbianos mediante CCFCD y ANN se comparó además con una colección de parámetros estadísticos que se estimaron para el modelo general, así como para los grupos de entrenamiento y validación de CCFCD y ANN (Tabla 5). Los valores R2 de la ANN fueron altos para ambos grupos que el modelo CCFCD. A diferencia de CCFCD, RMSE y MAD registraron valores más bajos para ANN. Se observó la misma tendencia para el modelo general, es decir, mayor valor de R2 y RMSE, MAD y SSE inferiores de ANN en comparación con CCFCD, deduciendo una mayor confianza del modelo de ANN que de CCFCD.

Como se analizó anteriormente, R2 se utiliza para determinar la asociación entre la respuesta de los CNP y los valores proyectados; por lo tanto, un valor mayor en ANN designa una asociación más significativa entre los dos conjuntos de datos que la que se informa en CCFCD. RMSE participa en la evaluación de regresión para validar los resultados de las pruebas, ya que un valor menor indica que los datos se agregan alrededor del área de mejor ajuste. MAD es otra cifra que indica la dispersión promedio de los datos alrededor de la media. Un valor MAD menor infiere una dispersión reducida de los datos alrededor de la media. El valor de SSE es una prueba adicional de bondad de ajuste, que se utiliza para calcular la divergencia total de los valores reales con respecto a los ajustados; un valor más bajo designa que el modelo es apropiado en mayor medida. Los datos actuales concuerdan con los estudios recientes que encontraron que el modelo ANN era superior al RSM, registrando valores más bajos de RMSE, MAD y SSE y valores mayores de R221,69. En consecuencia, ANN tiene una mejor capacidad de generalización que CCFCD.

La validación experimental de los modelos CCFCD y ANN para la maximización de la biosíntesis de CNP por la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus se verificó utilizando los valores teóricos calculados de los cuatro factores probados. La función de deseabilidad se utilizó para encontrar las mejores condiciones para la biosíntesis máxima de CNP. Para validar ambos modelos, ambos modelos estimaron que los valores teóricos óptimos que maximizan la biosíntesis de CNP eran 5,5 pH inicial, 1,3% de quitosano, 40 °C y un período de incubación de 12 h. La correspondiente biosíntesis de CNP estimada basada en CCFCD y ANN fue de 9,29 y 9,44 mg/ml, respectivamente. En estas condiciones, los valores teóricos se evaluaron experimentalmente. El valor experimental de los CNPs sintetizados microbianamente por la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus fue de 9,52 mg/mL, lo que confirma un gran grado de precisión de ambos modelos. Sin embargo, el valor estimado por ANN fue mucho más cercano al experimental que el estimado por CCFCD, lo que demuestra nuevamente que ANN tiene un poder predictivo avanzado que el modelo CCFCD. Esta suposición, de hecho, proporciona una indicación sólida de la idoneidad del diseño y del procedimiento de modelado, aplicando las matrices probadas de los cuatro factores en el proceso de biosíntesis de CNP bacterianos.

El pH óptimo actual de 5 se informó anteriormente como superior al rango neutro a pH 7, las nanopartículas con un pH inferior a 7 tienden a ser más pequeñas y globulares, mientras que las partículas creadas a un pH fuera de 7 tienden a ser no esféricas y de mayor tamaño o aglomeración de pequeñas partículas70. Nuestros estudios de caracterización respaldan tales resultados.

Con respecto a la concentración actual de quitosano de 1,295 mg/mL, la intensidad del quitosano impacta poderosamente en el tamaño y el crecimiento de las nanopartículas. La concentración de quitosano a 1,0 mg/ml estuvo entre las mejores condiciones para generar CNP con el tamaño más bajo (95 nm) en comparación con las concentraciones más altas71.

La temperatura de reacción de 40 °C en el estudio actual podría considerarse adecuada desde un punto de vista biotecnológico. Dado que la temperatura de reacción juega un papel clave en el desarrollo de partículas y en el control de forma/tamaño, la temperatura de reacción puede influir en gran medida en la velocidad de reacción y, por lo tanto, en las características de las partículas72. Los hallazgos de caracterización actuales respaldan los datos recuperados del proceso de optimización en cuanto a forma y tamaño.

El período de incubación actual de 12 h es un tiempo razonablemente adecuado ya que Saifful y Shahidan73 informaron que la prolongación del tiempo de incubación (18 h) generó un tamaño promedio más alto de nanopartículas en comparación con el tiempo más corto (2 h). Vaezifar et al.71 también llegaron a la misma conclusión.

A diferencia de los modelos de cálculo de un solo paso, la alta precisión de la capacidad predictiva de las RNA puede deberse a su amplia capacidad para estimar la no linealidad del sistema20,21. Sin embargo, existen algunos inconvenientes del modelado de ANN, de los cuales ANN devora un período computacional completo a través de iteraciones de estimaciones, y la naturaleza organizada no puede demostrar las contribuciones y la importancia de cada factor en el modelo, por lo que los factores en el modelo no se pueden reducir o reducir. eliminado del modelo21.

La actividad antibacteriana del quitosano y los CNP preparados se investigó contra la bacteria patógena de plantas Pectobacterium carotovorum mediante difusión en agar y un ensayo de inhibición del crecimiento. Los CNP mostraron una zona de inhibición significativa (19 mm) contra las bacterias patógenas en comparación con la solución de quitosano (11 mm), como se muestra en la Fig. 14A, B. Los CNP suprimieron notablemente el crecimiento bacteriano al aumentar su concentración en un medio líquido. La concentración más baja de CNP que puede impedir el crecimiento de bacterias se registró en 2 mg/ml.

Ensayo de actividad antimicrobiana de (A) CNP y (B) estándar de quitosano contra Pectobacterium carotovorum, (C) La concentración inhibidora mínima (CMI) de quitosano y CNP biosintetizados por la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus.

El quitosano es conocido como un polímero natural, no tóxico y con actividad antibacteriana. En el ámbito agrícola, el quitosano se puede utilizar como pesticida natural para prevenir y controlar enfermedades de las plantas74,75. El quitosano en nanoescala proporcionó actividades novedosas y únicas que incluyen efectos antimicrobianos, antitumorales y un sistema de administración de fármacos71. En el estudio actual, los CNP mostraron una mayor actividad antibacteriana que el quitosano contra Pectobacterium carotovorum. Esto se debe a la forma esférica uniforme y al tamaño más pequeño de los CNP en comparación con el quitosano. El carácter policatiónico de los CNP les permite interactuar con la pared celular bacteriana cargada negativamente más que el propio quitosano. Además, los CNP tienen una gran superficie que facilita que se absorban firmemente en la superficie bacteriana. Esto provoca una alteración de la membrana celular y una fuga de compuestos intercelulares que a su vez afecta la viabilidad celular51. La penetración de los CNP en la célula bacteriana provoca daños en el ADN e impide la síntesis de proteínas a partir del ARN76. De acuerdo con otras investigaciones, nuestros resultados mostraron que los CNP inhiben el crecimiento de Pectobacterium carotovorum con un diámetro de 19 mm. Ahmed et al.77 informaron que los CNP inhiben el crecimiento de cuatro aislados de bacterias grampositivas (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) y gramnegativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) con un rango de diámetro de 9 a 16 mm. En otro estudio de Divya et al.78, informaron que el diámetro de la zona de inhibición producida por los CNP contra Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli oscilaba entre 12 y 16 mm.

La actividad antimicrobiana de los CNP varía dependiendo de una serie de factores como el tipo, el peso molecular, el grado de polimerización del quitosano, el disolvente utilizado, la temperatura y el valor del pH. Los CNP también exhiben propiedades antimicrobianas dosis dependientes y específicas de cada especie79. Las bacterias grampositivas mostraron más sensibilidad contra los CNP que las bacterias gramnegativas. Mientras que la pared celular de las bacterias grampositivas está compuesta por una gruesa capa de lipoproteínas y fosfolípidos, que conducen a un aumento de la carga negativa en la superficie celular80. En este estudio, la concentración mínima de inhibición de CNP contra Pectobacterium carotovorum fue de 2,0 mg/ml (Fig. 14C). Aliasghari et al.81 informaron que la concentración mínima inhibitoria (CIM) de CNP para cuatro cepas de Streptococcus oscilaba entre 1,25 y 2,5 mg/ml. De manera similar, los CNP tienen un efecto bactericida contra siete cepas bacterianas en concentraciones que varían entre 0,125 y 5 mg/ml77.

Se informó sobre un plan pionero basado en microbios para la síntesis de CNP utilizando un nuevo S. microflavus. Los CNP resultantes se identificaron completamente mediante investigación con microscopía electrónica, EDXS, espectroscopía FTIR cartográfica, termogravimetría y DSC, todo lo cual confirma la alta calidad del producto. Los parámetros del proceso se estudiaron y optimizaron para maximizar el rendimiento de CNP utilizando CCFCD e inteligencia artificial por primera vez en este tipo de biosíntesis. Sin embargo, los desafíos que deben resolverse y dilucidarse son la economía del proceso de producción a gran escala y su citotoxicidad en comparación con los CNP ordinarios, antes de que se permita su uso como resultado rentable.

Se utilizó la técnica habitual de placa de dilución para aislar Streptomyces sp. cepa NEAE-83, de una muestra de suelo recolectada de El Warraq, Gobernación de Giza, Egipto, en placas de Petri que contienen medio agar nitrato de almidón de la siguiente composición (g/L): almidón, 20; MgSO4.7H2O, 0,5; KNO3, 2; NaCl, 0,5; K2HPO4, 1; FeSO4.7H2O, 0,01; CaCO3, 3; agar, 20. Las placas de Petri se incubaron a 30 °C durante 7 días. Las cepas aisladas se mantuvieron en glicerol al 20% (v/v) como suspensiones de esporas a -20 °C.

Se licuó una masa de bajo peso molecular (Sigma-Aldrich) al 2 % (p/v) con ácido acético al 0,5 % (v/v) y luego se elevó a pH 4,8–5,0 con NaOH 1 N bajo agitación magnética durante 24 h y se completó. a 200 ml.

El medio de crecimiento óptimo del actinomiceto Streptomyces sp. cepa NEAE-83 (concentración de inóculo) fueron K2HPO4 (0,05%), MgSO4 (0,05%), NaCl (0,05%), KNO3 (0,1%), FeSO4 0,7H20 (0,001%), extracto de levadura (0,03%), almidón ( 2%), y pH 7,5. Se mezcló un volumen de 2 ml de filtrado de cultivo con 1 ml de solución de quitosano (1%) y se incubó a 30 °C durante 12 a 36 h con agitación a 150 rpm para obtener una solución opalescente.

La suspensión coloidal se centrifugó (10 min a 10.000 xg). El precipitado resultante se lavó dos veces para eliminar el ingrediente que no había reaccionado. El resultante se disolvió nuevamente en ácido acético al 1%. Los CNP biosintetizados se determinaron y monitorearon a través del espectro UV-visible detectando la absorbancia máxima mediante el espectrofotómetro Optizen Pop-UV/VIS de doble haz en una matriz entre 200 y 400 nm. A continuación se liofilizó el precipitado. Se hizo una curva de calibración a partir de CNP, utilizando concentraciones conocidas (mg/mL) mediante disolución en ácido acético al 1% para estimar el rendimiento neto de CNP.

La superficie de las esporas y el patrón de la cadena de esporas de la bacteria se investigaron en agar nitrato de almidón después de crecer a 30 °C durante 14 días. La bacteria deshidratada recubierta de oro se examinó en varias amplificaciones con SEM analítico (Jeol JSM-6360 LA).

Las características fisiológicas, por ejemplo, producción de pigmentos difusibles y melanoides (en medio de caldo de triptona de extracto de levadura y medios de agar de peptona-extracto de levadura-hierro y tirosina), coagulación y peptonización de la leche, hidrólisis de almidón, quitosanasa, L-asparaginasa. , se determinaron proteasa, uricasa, celulasa, reducción de nitratos, licuefacción de gelatina, producción de H2S y tolerancia a NaCl2. La capacidad de Streptomyces sp. También se aclaró la cepa NEAE-83 para impedir el crecimiento de algunas bacterias (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella sp. y Escherichia coli) y hongos (Fusarium solani, F. oxysporum, Alternaria solani, Bipolaris oryzae y Rhizoctonia solani)2 .

Las células se recogieron en un tubo de microcentrífuga de 2 ml mediante centrifugación a 5000 x g durante 10 minutos y se eliminó el sobrenadante. El ADN genómico se preparó según lo descrito mediante el método de amplificación por PCR del gen 16S rRNA que se realizó utilizando el protocolo de El-Naggar et al.17. El lisado preparado se purificó utilizando una columna de purificación de ADN genómico GeneJETTM. La reacción de amplificación por PCR se realizó en una mezcla de 25 µl de mezcla maestra de PCR Maxima Hot Start (2X), 1 µl de 20 pmol de cebador directo de ARNr 16S 27f. (5′-AGAGTTTGATCMTGCCTCAG-3'), 1 μl de 20 pmol de cebador inverso de ARNr 16S 1492 r (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′), 5 μl de ADN molde y 18 μl de agua, libre de nucleasas.

El ciclado térmico del aparato de PCR se programó según lo recomendado (10 min a 95 °C para la desnaturalización inicial y activación enzimática, seguido de 35 ciclos de amplificación de 30 s a 95 °C, 1 min de hibridación a 65 °C y 1,5 s). min a 72 °C, seguido de extensión final durante 10 min a 72 °C). Después de eso, la mezcla del producto de la PCR se pasó por electroforesis en gel de agarosa y se purificó con el kit de purificación de PCR GeneJET™ (Thermo K0701). La PCR purificada resultante se secuenció en GATC Company usando un secuenciador de ADN ABI 3730xl usando cebadores directos e inversos. La secuencia del gen 16S rRNA de Streptomyces sp. La cepa NEAE-83 (1214 pb) se eliminó de la base de datos GenBank para recuperar el número de acceso.

La secuencia genética de Streptomyces sp. La cepa NEAE-83 se comparó con las secuencias de esas otras cepas de Streptomyces en las bases de datos GenBank (EMBL, DDBJ y PDB), y las secuencias del gen 16S rRNA se usaron para construir un árbol filogenético (árbol de unión de vecinos) para mostrar las relaciones. entre Streptomyces sp. cepa NEAE-83 y especies de Streptomyces interrelacionadas. Se utilizó el paquete de software MEGA-X.

Los CNP generados se recubrieron con pulverización catódica de oro (módulo SPI), luego se inspeccionó la morfología, el tamaño y la construcción mediante SEM (modelo JEOL-JSM-IT200) a 20 kV. TEM realizó otro examen morfológico de los CNP. Se inspeccionaron muestras de los CNP generados con la unidad TEM (TEM; JEM-2100 Plus, JEOL Ltd., Japón).

EDXS descubrió la caracterización y configuración elemental de los CNP. Para adquirir un conocimiento profundo sobre los CNP, se utilizó el haz de electrones del SEM para examinar los CNP individuales. Se analizaron los datos obtenidos utilizando el programa.

El análisis de mapeo se realizó con la ayuda de SEM para tomar una imagen general de los CNP para estudiar su composición y distribución.

Se utilizó dispersión láser dinámica (DLS) utilizando el analizador de tamaño de partículas submicrónico N5 Beckman Coulter para medir la distribución del tamaño de partículas de los CNP.

Las propiedades de carga superficial de los CNP se cuantificaron utilizando el potencial ζ a través del software analítico Malvern Zetasizer (versión 7.13) fortificado con un láser Doppler y distinguido por el análisis de fase de dispersión de luz. Las determinaciones se realizaron a 25 °C y los CNP se tomaron en estado líquido82.

Las propiedades de la superficie de los CNP se realizaron mediante espectroscopía FTIR, utilizando el espectrofotómetro Shimadzu FTIR-8400 S. Los CNP se trituraron utilizando gránulos de KBr y luego se realizó el espectro FTIR a una resolución de 1 cm-1 en el rango entre 4500 y 500 cm-1.

Las propiedades estructurales de los CNP se dilucidaron mediante XRD, que es una práctica vital para descubrir el patrón XRD. Se utilizó el difractómetro (Bruker D2 Phaser 2nd Gen), mediante el cual los rayos X funcionan con un ánodo de Cu de 30 kV y 10 mA. La intensidad de la difracción se determinó a 25,7 °C con una velocidad de escaneo de 2°/min para 2θ = 10–50 de Khan et al.83.

La muestra de CNP se preparó secando a 60 °C durante 1 h antes de montarla en un recipiente de muestra de platino. La TGA se realizó con un caudal de 20 ml min-1 en el rango de 25 a 500 °C. El termoanalizador (50-H) se usó bajo una atmósfera de nitrógeno a una velocidad de aumento de 10 °C min-1. El diagrama se trazó como el porcentaje de pérdida de peso frente a la temperatura.

El patrón de pirólisis de CNP de DSC se estimó después de secar durante 1 h a 60 °C. La muestra de CNP se montó en la bandeja de aluminio. La prueba DSC (60-A) se realizó en atmósferas de nitrógeno con relaciones de flujo y calentamiento de 30 ml min-1 y 10 °C min-1, respectivamente. El comportamiento del termograma se exploró entre 25 y 500 °C. La temperatura superior del DSC fue la temperatura de descomposición original de los CNP, según lo informado por el examen termogravimétrico. El diagrama se trazó como temperatura versus flujo de calor.

El diseño central compuesto centrado en caras (CCFCD) es un enfoque eficaz que se utiliza ampliamente en procedimientos de optimización porque proporciona suficiente información para confirmar la precisión del modelo sin necesidad de una gran cantidad de experimentos, minimizando el costo total del experimento84. La matriz de CCFCD se creó para determinar la mayor combinación de los factores probados que afectan la biofabricación de CNP por la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus. Se aplicaron tres niveles de cada variable (codificados como − 1, 0, + 1). Al diseño se le asignaron 5 puntos centrales. En consecuencia, se generaron treinta ejecuciones (Tabla 2). Se utilizaron los valores codificados ya que la codificación es mejor para identificar el impacto relativo de los factores comparando los coeficientes de los factores. Los valores codificados de los factores investigados se estimaron a partir del valor real mediante la siguiente función:

donde xi es el valor codificado de un factor probado, Xi es el valor real de un factor probado, X0 es el valor real del factor probado en el punto medio y ∆Xi es el cambio gradual en el valor real de la variable i .

Los niveles reales fueron el pH inicial; 4,5–5,5, concentración inicial de quitosano; 1-2%, temperatura; 30–40 °C y período de incubación; 12 a 36 h. Se estimaron los efectos lineales, cuadráticos y mutuos de los factores de proceso designados para descubrir la conexión entre la generación de CNP y el nivel óptimo de los factores examinados que influyen en el proceso de biosíntesis. Se utilizó la siguiente ecuación polinómica de segundo orden:

donde Y es la biosíntesis de CNP utilizando la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus, Xi es el nivel de la variable de proceso, β0 son los coeficientes de regresión, βi es el coeficiente lineal, βij son los coeficientes mutuos y βii son los coeficientes cuadráticos.

Se construyó un programa de red neuronal completamente vinculado, empleando varios nodos dentro de sus capas. Todos los nodos tienen una función de activación NTanH. Para desarrollar un modelo de predicción utilizando inteligencia artificial, se emplearon la matriz CCFCD y datos experimentales (Tabla 2) para entrenar el perceptrón multicapa conectado de ANN. Los datos del CCFCD se dividieron en entrenamiento (para crear pesos neuronales y minimizar el error de predicción), validación (para elegir el mejor modelo y detener el entrenamiento) y prueba (para evaluar la competencia de pronóstico de las ANN).

La topología de ANN de diseño se compone de la capa de entrada fijada por los cuatro factores independientes y la capa de salida que tiene una sola neurona fija (biosíntesis de CNP por la cepa NEAE-83 de Streptomyces microflavus). En el medio, estaban las capas ocultas que se examinaron utilizando varios criterios, incluido el número de neuronas, la tasa de propagación de retención y las tasas de aprendizaje. La topología de ANN se designa como 4-h-1.

Se utilizó el procedimiento de prueba y error para la selección del modelo y la evaluación de la eficacia del aprendizaje automático, que se determinó con base en las pruebas RMSE, MAD, SSE y R2. Además, los resultados previstos estaban muy cerca de la respuesta real de la biosíntesis de CNP. La aptitud de los modelos CCFCD y ANN se comparó con los valores experimentales correspondientes.

Se utilizó el software Design Expert (versión 13, Stat-Ease, Minneapolis, EE. UU.) para configurar la matriz de diseño del CCFCD y realizar los exámenes estadísticos. El procedimiento de aprendizaje automático, la construcción de la topología de ANN y los exámenes estadísticos se realizaron con la ayuda del paquete de software; JMP pro, versión 16.2 (JMP, SAS Institute Inc., Cary, NC), mediante el cual se realizaron los procesos de capacitación, validación y pruebas.

Se subinoculó un cultivo madre de Pectobacterium carotovorum (proporcionado amablemente por el Dr. Muhammad Zayed, Departamento de Botánica y Microbiología, Universidad de Menoufia, Egipto) en medio de caldo Luria-Bertani (LB) estéril y se incubó durante la noche a 30 °C con agitación. Después de 24 h, la suspensión bacteriana se ajustó a 108 UFC/ml (estándar McFarland 0,5) con solución salina estéril. Se esparcieron cien microlitros de la suspensión bacteriana sobre la superficie de una placa de agar LB utilizando hisopos estériles. Luego, sobre la superficie de las placas inoculadas se colocó un trozo de tela de 1 cm de diámetro saturado con 20 µg de CNPs y otro trozo de tela saturado con 20 µg de estándar de quitosano. Las placas se mantuvieron en refrigeración para mejorar la difusión del material en agar y las placas se incubaron a 30 °C durante 18 h.

La CIM de los CNP se determinó mediante el método de microdilución contra Pectobacterium carotovorum. Las soluciones madre de estándar de quitosano y CNP se diluyeron en serie de 0,25 a 2,0 mg/ml en caldo LB y se dispensaron uniformemente en una placa de microtitulación de 96 pocillos estéril por triplicado para cada concentración. Cada pocillo se inoculó con 20 µL de una suspensión bacteriana (105 UFC/pocillo). Como controles negativos se utilizaron pocillos que contenían medio de cultivo y diferentes concentraciones de estándar de quitosano y CNP sin inoculación. El crecimiento bacteriano se estimó mediante mediciones de turbidez a 550 nm después de una incubación durante la noche.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y su archivo de información complementaria.

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Los autores agradecen a la Ciudad de Investigación Científica y Aplicaciones Tecnológicas (SRTA-City), Alejandría, 21934, Egipto, por brindar apoyo financiero para las mediciones y análisis de laboratorio de este artículo dentro del marco de los Servicios de Laboratorios Centrales de SRTA-City.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) en cooperación con el Banco Egipcio de Conocimiento (EKB).

Departamento de Desarrollo de Bioprocesos, Instituto de Investigación en Ingeniería Genética y Biotecnología, Ciudad de Investigación Científica y Aplicaciones Tecnológicas (Ciudad SRTA), Ciudad de New Borg El-Arab, Alejandría, 21934, Egipto

Noura El-Ahmady El-Naggar y Nashwa H. Rabei

Departamento de Protección Vegetal y Diagnóstico Biomolecular, Instituto de Investigación sobre Cultivos en Tierras Áridas, Ciudad de Investigación Científica y Aplicaciones Tecnológicas (Ciudad SRTA), Ciudad de New Borg El-Arab, Alejandría, 21934, Egipto

Shima I. Bashir

Unidad de Actividad Microbiana, Departamento de Microbiología, Instituto de Investigación de Suelos, Agua y Medio Ambiente, Centro de Investigación Agrícola, Giza, 12619, Egipto

WesamEldin IA Sabre

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NEE propuso el tema de investigación, diseñó el plan de investigación, proporcionó las herramientas necesarias para los experimentos e instrucciones experimentales, recopiló los datos, realizó el análisis estadístico y contribuyó a la interpretación de los resultados, redacción y revisión del manuscrito. SIB llevó a cabo los experimentos de actividad antimicrobiana y contribuyó a la redacción y revisión del manuscrito. NHR llevó a cabo algunos de los experimentos. Interpretación WIS de los resultados, redacción y revisión del manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondence to Noura El-Ahmady El-Naggar.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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El-Naggar, N.EA., Bashir, SI, Rabei, NH et al. Biosíntesis innovadora, optimización basada en inteligencia artificial y caracterización de nanopartículas de quitosano por Streptomyces microflavus y su potencial inhibidor contra Pectobacterium carotovorum. Representante científico 12, 21851 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25726-w

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Recibido: 10 de mayo de 2022

Aceptado: 05 de diciembre de 2022

Publicado: 17 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25726-w

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